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NatureMethods年度技术:单粒子低温电二手锅炉子显微镜
时近岁末,各大杂志接连进行了年终盘点,12月30日的《NatureMethods》也盘点了年度技术,选出了2015年最受关注,影响广泛减速机的技术成2、标准配置问题果:单粒子低温电子显微镜(cryo-EM)。
一个蛋白质或蛋白质复合物的三维结构可以提供有关其生物学功能的重要见解。作为一种结构测定技术,单粒子cryo-EM的位次仅居于高分辨率方法X-射线晶体学及核磁共振(NMR)光谱法之这款新品更轻后。由于近年来的技术进展使得现在能够利用cryo-EM解析近原子分辨率结构,这种情况正在迅速地发生改变。
数十年里,X-射线晶体学一直是解析蛋白质结构的首选方法。然而,许多的蛋白质,尤其是膜蛋白和蛋白质复合物却难以结晶。一些替代传统晶体学的方法存在各自不同的局限性。例如,串行飞秒激光晶体学(serialfemtosecondcrystallography)技术利用了X射线自由电子激光(XFEL),不再要求单一大蛋白结晶而是获得大量容易生成的微晶体,然而在高度专业化的XFEL下光束线时间(beamtime)的竞争是非常激烈的。NMR光谱法可用来解析小蛋白的结构,但仍然难以将其应用于较大的蛋白。
加扰机不同于晶体学,cryo-EM尤其适宜于获得大蛋白质复合物及显示多种构象或组成状态的一些系统的结构信息。过去的数十年,在这一最初很小的领域中的研究人员一直在稳步地前进,提高cryo-EM的分辨率并进而扩大它的生物适应性。EvaNogales在本期的NatureMethods杂志上介绍了cryo-EM成为一种主流结构生物学技术的开发史。
这一曾经很小的领域现正在突飞猛江淮配件进。一种新型的高度敏感直接探测照相机可直接捕捉到电子,有可能实现分辨率的飞跃。第一批探索这些新型探测器的论文发布于2013年,2014年看到了几篇用cryo-EM解析一些重要的高分辨率结构的论文。2015年,多项研究已突破了3埃的分辨率障碍——这一前所未有的壮举甚至让一些长期的cryo-EM从业者都感到惊讶。
但一台好的检测器并非是万能的。一项成功的cryo-EM研究很大程度上依赖于好的样本制备以及复杂的图像处理软件。AllisonDoerr在本期的NatureMethods杂志上探讨了这一问题。
cryo-EM分辨率变革才刚刚开始,RobertGlaeser在一篇评论文章中对此进行了探讨。检测器技术敏感度增高为开发出一些新的改良方法带来了机会,这些方法将进一步推动提高分辨率、适用性和易用性。尽管cryo-EM尤其适用于大型蛋白质复合物,到目前为止研究的这些蛋白质复合物都主要是一些容易摘到的果实。当前迫切需要一些实用、可重复的、通用样本制备方法来扩展cryo-EM的适用性,检测出迄今为止所有结构技术无法确定的结构。数据分析方法也需要进一步的改进,研究人员希望得到一些简单的、可靠的计算方法将原始的二维图像转变为三维的蛋白质结构,尤其用于检测具有结构异质性的系统。
是控制和引导其生物学反应、避免异体反应的关键
像所有处于飞速增长期的科学领域一样,cryo-EM也有成长的烦恼。本期的NatureMethods杂志的一篇专稿讨论了这一问题。令人鼓舞的是,许多的国家都在建设具有高端仪器的国家用户设施,然而当前这一高端仪器供不应求。许多研究人员都盼望能够利用这一技术,但cryo-EM并非是一种自动化技术(至少目前不是)。在样本制备和数据分析过程中有许多复杂的步骤,研究人员必须小心地正确应用、记录和验证以避免犯错误。确保新cryo-EM从业人员接受适当的培训至关重要。
不过,cryo-EM的这些发展并未意味着晶体学的终结,X-射线晶体学将仍然是一种用于解析容易结晶的蛋白质结构的强大技术。
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